Схема ацетоно-бутилового брожения крахмалистого сырья.
На основании критического обзора литературных данных по исследованиям ацетоно-бутилового и родственных ему брожений, а также основываясь на результатах своих исследований, составлена новая схема ацетоно-бутиловсго брожения. Прежде чем перейти к рассмотрению ее, необходимо вкратце изложить некоторые данные, положенные в основу этой схемы.
Изменение соотношения растворителей При сбраживании различных углеводов ацетоно-бутиловыми бактериями всегда наблюдались колебания в выходах отдельных растворителей в зависимости от состава сбраживаемых сред и условий, брожения. Вероятному химизму брожения могут удовлетворять только те схемы, в которых предусматривается возможность разветвлений процесса и гибких переключений в сторону образования того или иного конечного продукта. Такой вывод вытекает из многочисленных экспериментальных данных; к нему приходят и другие исследователи. Так, например, Клюйвер [3] считает, что, исходя из возможности нескольких разветвлений метаболического пути бактерий, можно понять значительную изменчивость количественных соотношений между конечными продуктами ацетоно-бутилового брожения. В качестве общего для ацетона и спиртов промежуточного продукта брожения им принимается так называемый «активный ацетат», который, в зависимости от внешних условий (температуры, рН и пр.), может образовывать преимущественно тот или иной из конечных продуктов брожения. В качестве наглядного примера изменения направления брожения приведем результаты наших опытов по сбраживанию при разных температурах кукурузной муки, из которой получены высокие выходы этанола (табл.) С понижением температуры брожения снижался выход этанола и возрастал выход бутилового спирта. Несколько увеличивался также выход ацетона. Таблица Изменения соотношений растворителей при разных температурах брожения кукурузной муки (концентрация заторов по сахару 4,1 %)
Молярное соотношение бутилового и этилового спиртов составляло 1 : 1 при температуре брожения 37°, 1 : 2 при 35—34° и 1:3, 1:5 при 32—30°. Уменьшение числа молей этанола соответствовало в среднем удвоенному приросту числа молей бутанола и ацетона. Повышение выходов бутанола при пониженной температуре брожения было известно и ранее [5], но соответствующее снижение выходов этанола никогда так отчетливо не наблюдалось. Предлагаемая нами схема ацетоно-бутилового брожения хорошо объясняет различные пути превращения ацетилфосфата в этанол или бутанол.
Об «активном ацетате» «Активный ацетат» представляет собой ацетилированную форму кофермента А. Ацетил-КоА был выделен из дрожжей [28], он действует как ферментативный ацетилирующий агент. Было доказано, что ацетильная группа связана с атомом серы (СНзСО SКоА); известно также, что кофермент А содержит аденозин-5-фосфат, две дополнительные фосфорные группы, пантотеновую кислоту и тиоэтаноламин. Ацетил-КоА устойчив к нагреву; так, при рН 3—7 выдерживает нагрев до 100° в течение 15 минут [6].У некоторых бактерий (Сl. kluyveri и др.) найден фермент, названный трансацетилазой, катализирующий реакцию переноса ацетила с ацетилфосфата на кофермент А [34]:
При этом образование ацетилфосфата может быть вторичным из ацетил-КоА, так как действие трансацетилазы обратимо. Роль кофермента А была изучена Баркером [18] в маслянокислом брожении, вызываемом бактериями Сl. kluyveri . При этом была исследована и расшифрована связь между ацетилфосфатом и ацетил-КоА в процессе окисления этанола до ацетил-КоА. Это обратимый двухстадийный процесс, катализируемый в первой фазе специфической дегидрогеназой и во второй фазе—ацетальдегидной дегидрогеназой:
Имеющийся в среде свободный кофермент А постепенно связывается уксусным альдегидом, превращаясь в ацетилированную форму. Когда весь кофермент А оказывается связанным, дальнейшая реакция окисления этанола прекращается. Если же в среду добавить ортофосфорную кислоту, то в присутствии фосфотрансацетилазы происходит перенос ацетильной группы от кофермента А на фосфорную кислоту; при этом образуется ацетилфосфат и регенерируется свободный кофермент А. Таким образом может продолжаться дальнейшее окисление уксусного альдегида. Баркер считает, что ацетилфосфат может играть главную роль в маслянокислых брожениях. Из замороженных клеток Сl. butylicum был получен растворимый ферментный препарат, который катализировал превращение пировиноградной кислоты в уксусную кислоту, СО2 и Н2. При этом для разложения пировиноградной кислоты требовалась фосфорная кислота и происходило образование ацетилфосфата [27]. Можно полагать, что в зависимости от направления процесса эти два соединения—ацетилфосфат и ацетилкофермент А—могут быть взаимными переносчиками активной ацетильной группы, высвобождая тот или иной катализатор. О взаимосвязи этих соединений в процессе ацетоно-бутилового брожения никаких определенных данных нет. Следует отметить, что в ряде опытов при замене свыше 50% муки мелассой [17] или гидролизатами (наши исследования) брожение прекращалось при высоком остаточном сахаре. Эти же среды нормально сбраживались при дополнительном вводе фосфатов, что подтверждает важную роль последних в промежуточных продуктах брожения. У многих бактерий и у дрожжей образование ацетилкофермента А из пировиноградной кислоты обходится без промежуточного образования ацетилфосфата [6]. Превращение пировиноградной кислоты в ацетилированную форму кофермента А рассматривается как цепь из трех последовательных реакций. Сначала происходит декарбоксилирование, ведущее к образованию уксусного альдегида, присоединенного к простетической группе декарбоксилазы, которой является дифосфотиамин (ДФТ). Этот комплекс реагирует со специфическим катализатором—окисленной формой а-липоевой кислоты; альдегидная группа окисляется в ацетильную (уровень окисленности соответствует ацетату), а липоевая кислота восстанавливается. Затем происходит перенос ацетильной группы с комплекса на кофермент А. Липоевая кислота вновь превращается в окисленную форму [3]. В схеме нами показаны два возможных пути образования ацетилкофермента КоА из пировиноградной кислоты. По всей вероятности, для бактерий Сl. acetobutylicum [19, 35] и Сl. butylicum [27] ацетилфосфат является обязательным промежуточным продуктом брожения. Что касается непосредственного образования ацетил-КоА из пировиноградной кислоты этими бактериями, то пока нет данных, отрицающих или подтверждающих такую возможность.
Образование ацетона Образование ацетона путем декарбоксилирования ацетоуксусной кислоты наиболее убедительно доказано в ацетоно-бутиловом брожении. Соответствующий фермент декарбоксилаза ацетоуксусной кислоты был выделен из клеток. Сl. acetobutylicum, очищен и изучен [21, 221. Фермент устойчив к нагреванию, выдерживает температуру до 70°; почти полностью разрушается в течение 5-минутного нагрева при 85°. Температурный коэффициент его действия: С 20/30 =1,82 и С30/40 = 2,16.Наиболее активен при рН 5,0. Устойчив к меди (при 2М ·10-2 СuSО4 оставалось 59% активности), но очень чувствителен к серебру и ртути. Предполагают, что рибофлавинфосфат является простетической группой фермента [22]. Декарбоксилаза ацетоуксусной кислоты не обнаружена в фильтрате культуры, поэтому ее считают внутриклеточным ферментом [26].Образование ацетоуксусной кислоты происходит путем синтеза двух молекул ацетилкофермента под действием фермента тиолазы [18, 35]. Ацетоуксусная кислота освобождается из ацетоуксуснокислого S Ко А путем переноса кофермента А на уксусную кислоту под воздействием фермента трансферазы:
Б аркер [18] показал эту реакцию для бактерий Сl. kluyveri и считает ее весьма вероятной для Сl. acetobutylicum, хотя прямых доказательств ее для этих бактерий пока не получено.
Образование бутанола Образование бутанола в процессе ацетоно-бутилового брожения, как было доказано многими экспериментальными данными, идет через масляную кислоту. За последние годы накоплен интересный экспериментальный материал, дающий возможность расшифровать процессы биологического окисления и синтеза масляной кислоты. Образование ацетил-КоА является первым этапом синтеза масляной кислоты. Фермент тиолаза катализирует синтез ацетоацетил-КоА из двух молекул ацетил-КоА. Восстановление кетокислоты в оксикислоту происходит под воздействием фермента ( S-кеторедуктазы (р-гидроокси-маслянокислой дегидрогеназы). Образование кротоновокислого-SКоА происходит под воздействием фермента кротоназы, путем дегидратации р-оксимаслянокислого-SКоЛ. Кротоновокислый-SКоА под воздействием дегидрогеназы восстанавливается в маслянокислый-SКоА [6]. Все реакции обратимы.Такой же путь синтеза масляной кислоты был показан Баркером с сотрудниками при работе с ферментными препаратами, полученными из клеток бактерий Сl. kluyveri [18]. Свободная масляная кислота образуется путем переноса группы SКоА на уксусную кислоту. Фермент, катализирующий эту реакцию, был выделен, частично очищен и назван коферментом А—трансферазой.Шульмайстер, Нисман и Когэн [33] изучали стадии синтеза масляной кислоты бактериями Сl. saccharobutylicum. В экстрактах из клеток, разрушенных ультразвуком и растиранием с кварцевым порошком, были обнаружены ферменты: тиолаза, катализирующая синтез ацетоуксуснокислого-SКоА из ацетил-КоА; р-кетогидрогеназа, катализирующая реакцию:
Приведенные исследования указывают на общность процессов синтеза масляной кислоты с ферментными системами различных масляно-кислых микроорганизмов. Баркером был исследован также процесс ферментативного образования бутанола бактериями С l. kluyveri [18]. Исходным субстратом в этих опытах служил маслянокислый фосфат. При этом получался маслянокислый-SKoA, который под действием фермента альдегиддегидрогеназы восстанавливался до масляного альдегида. Второй стадией было восстановление масляного альдегида до бутилового спирта под действием спиртовой дегидрогеназы.Аналогичный путь синтеза масляной кислоты и бутанола Баркер считает вполне вероятным для Сl. acetobutylicum. По мнению автора, промежуточным продуктом в этом случае должна быть свободная масляная кислота, образующаяся, например, по следующей реакции;
Выделение из бесклеточного экстракта Сl. acetobutylicum фермента фосфотрансбутирилазы [23] подтверждает реакцию взаимного превращения маслянокислого фосфата и масляной кислоты. Возможные пути синтеза масляной кислоты и бутанола ацетоно-бутиловыми бактериями были подробно рассмотрены при изучении промежуточных продуктов брожения (см. сообщение I). Результаты многих исследований (особенно работы Вуда, Броупа и Веркмана [37], Штерна и сотрудников [35]) говорят в пользу таких же путей синтеза этих продуктов.
Схема ацетоно-бутилового брожения Предлагаемая схема ацетоно-бутилового брожения согласуется с данными балансов брожения, объясняет возможные сдвиги в соотношениях продуктов брожения, а также важную роль уксусной кислоты (или ацетатионов) в ацетоно-бутиловом брожении, что неоднократно наблюдалось нами в процессе различных исследований [10, 11]. Активизирующее влияние ацетатионов в ацетоно-бутиловом брожении отмечалось также Шодлером [32]. Роль уксусной кислоты в соответствии со схемой должна заключаться в высвобождении ацетоуксуснон и масляной кислот из их соединений с коферментом А, что, во-первых, ведет к ускорению образования ацетона и бутанола, а во-вторых—регенерирует ацетил-КоА, чем обеспечивается сохранение активности всего процесса. Мы полагаем, что значительным содержанием уксуснокислого кальция можно объяснить активизирующую роль нейтрализованных известью пентозных гидролнзатов кукурузной кочерыжки в условиях сбраживания их в смеси с мучными заторами бактериями С l. acetobutylicum. Быстрое и легкое сбраживание арабинозы также может быть следствием образования больших количеств уксусной кислоты в процессе распада этого сахара.Рассматриваемая схема наиболее полно отражает возможный химизм ацетоно-бутилового брожения с учетом известных достижений химии ферментов для родственных бродильных процессов. Следует еще отметить причины сдвигов в соотношениях растворителей в зависимости от степени восстановленное™ или окисленности сбраживаемого субстрата. При образовании из одной молекулы гексозы двух молекул пировиноградной кислоты должно выделиться 2 молекулы водорода (С6Н 12О6 -> 2С3Н4О3 + 2H2). Это соответствует общему балансу водорода в брожении. Если же исходными продуктами будут маннит или глюконат кальция, то при этом выделятся соответственно 3 и 1 молекулы водорода.Схема ацетоно-бутилового брожения
Количество водорода, образующегося при распаде исходного продукта, и определяет восстановительный или окислительный характер брожения.
Выводы 1. Исследованы динамика и баланс ацетоно-бутилового брожения на крахмале, ксилозе и арабинозе. Показаны принципиальные различия в характере сбраживания указанных пентоз и предложены соответствующие схемы. 2. Сбраживание ксилозы предполагается путем предварительного превращения ее в гексозу с последующим распадом на трехуглеродные цепочки: 6С 5 -> 5С6 -> 10С3.Сбраживание арабинозы происходит путем непосредственного распада ее на трех- и двууглеродные цепочки: 3. Рассмотрены вопросы химизма ацетоно-бутилового брожения. Предложена возможная схема брожения, хорошо объясняющая наблюдаемые сдвиги в соотношениях растворителей и влияние ряда факторов на процесс брожения . |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
