|
|
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Биобутанол (Бутиловый спирт) Бутанол может быть использован как топливо в двигателе внутреннего сгорания Схема получения биобутанола из крахмалистого сырья. Переработка целлюлозы / клетчатки Химизм ацетоно-бутилового брожения Отходы ацетоно-бутилового производства. Ацетоно-бутиловая барда.
|
I. ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ АЦЕТОНО БУТИЛОВОГО БРОЖЕНИЯ Ацетоно-бутиловое брожение, вызываемое бактериями
Clostridium acetobutylicum, а также
многочисленными родственными При нормальных условиях брожения: необходимое азотистое и солевое питание, рН и окислительно-восстановительный потенциал среды, температура и пр. — могут сбраживаться самые разнообразные углеводы. Нормально, с обычным выходом растворителей (бутанол + ацетон + этанол), проходит брожение крахмала, декстрина, мальтозы, сахарозы, лактозы, глюкозы, фруктозы, маннозы, ксилозы, арабинозы и маннита; нехарактерно проходило брожение инулина и галактозы, отрицательные результаты были получены с сорбозой, сорбитом и глицерином [22]. Несбраживаемыми оказались также эритрит [32], дульцит [33] и ксилит. При сбраживании арабинозы повышался относительный выход ацетона, а при сбраживании маннита — выход бутанола. Конечными продуктами брожения являются ацетон, бутиловый и этиловый спирты, уксусная и масляная кислоты, ацетилметилкарбинол; образуются также незначительные количества изопропилового спирта, молочной и муравьиной кислот. Большая часть углеводов превращается в газы брожения — водород и углекислоту. Соотношение растворителей ( бутанол + ацетон + этанол )колеблется в значительных пределах в зависимости от самых разнообразных факторов(температуры, рН и пр.). Изучение химизма или, как иногда говорят, механизма ацетоно-бутилового брожения чрезвычайно важно, как с теоретической так и с практической точек зрения. Только знание химизма даЁт возможность управлять процессом ацетоно-бутилового брожения и добиться сдвига в соотношениях образующихся продуктов в желательном направлении. Еще в период с 1923 по 1940 г. было предложено несколько схем процесса ацетоно-бутилового брожения. Это схемы Спикмана (1923 г.), М. М. Шена (1927 г.), Клюйвера (1931 г.), Петерсона и Фреда (1932 г.) и В. Н. Шапошникова (1940 г.). Принципы этих схем изложены в статье М. Н. Бехтеревой и Н. Д. Иерусалимского [1] и в книге И. С. Логоткина [5].
Исследования химизма брожения проводились различными авторами и в последующие годы; были проведены работы с применением меченых атомов, спектрального анализа и других достижений науки последних лет. В этот период чрезвычайно развилась важнейшая отрасль биологической химии — химия ферментов. Вполне естественно, что на основе обширного материала, накопленного наукой, должны быть заново пересмотрены гипотезы и схемы процесса ацетоно-бутилового брожения. Рассмотрим предполагаемые и возможные промежуточные продукты ацетоно-бутилового брожения. Если считать, что распад гексоз до триоз происходит так же, как но схеме спиртового брожения, либо аналогично этому, то первыми промежуточными продуктами могут быть следующие соединения. Гексозодифосфат. По данным Симона [31], в нормальных условиях сбраживается суспензией клеток ацетоно-бутиловых бактерий в метилглиоксаль. В присутствии глютатиона образуется не метил-глиоксаль, а молочная кислота.
Этот же автор [32] указывает, что у шестого углеродного атома сбраживаемой гексозы обязательно должен быть гидроксил, для тоге чтобы образовывалась масляная кислота, как это имеет место в ацетоно-бутиловом брожении. Если же шестой углерод фосфорилирован, то образуется метилглиоксаль и пировиноградная кислота. По другим данным [20], сбраживания гексозодифосфата суспензией клеток ацетоно-бутиловых бактерий не наблюдалось.
d, l -Глицериновый альдегид СН2ОН— СНОП— СНО. Не сбраживался ацетоно-бутиловыми бактериями [32]; не подвергался воздействию отмытых клеток бактерий [30, 20].
Ф о с ф о г л и ц е р и н о в а я кислота. Не сбраживалась ацетоно-бутиловыми бактериями [32] и суспензиями покоящихся клеток этих бактерий [32, 20].
Фосфоглицериновая кислота, а также ее смесь с глицерофосфатом не подвергалась воздействию отмытых клеток бактерий [30]. Глицерин был единственным трехуглеродным соединением, которое давало масляную кислоту под воздействием отмытых клеток [30]. Пировиноградная кислота СН3СО — СООН. Сбраживалась суспензией клеток ацетоно-бутиловых бактерий [20]. В присутствии уксусной кислоты превращалась в основном в ацетон; из 1 моля пировиноградной кислоты и 0,2 моля уксусной кислоты получали 0,5 моля ацетона. Пировиноградная кислота рассматривается некоторыми авторами как предшественник ацетона, конденсируемый с уксусной кислотой в ацето-пировиноградную кислоту. При добавке в бродящий затор пировиноградная кислота сбраживалась в уксусную кислоту, ацетон и главным образом в ацетилметил-карбинол [23]. Нейберг и Аринштейн [10], добавляя к суслу соли пировиноградной кислоты, получили повышенный выход уксусной и муравьиной кислот при сбраживанни культурой В. ЪгйуНсиз. Авторы предлагают следующее уравнение:
Некоторые исследователи указывают, что пировиноградная кислота сбраживается отмытыми клетками Clostridium acetobutylicum с образованием только уксусной кислоты как в присутствии, так и в отсутствии глюкозы [30, 32]. По данным других исследователей, наряду с уксусной образуется и масляная кислота [19]. Суспензии отмытых клеток разных штаммов Clostridium acetobutylicum и родственных им организмов сбраживали пировиноградную кислоту, а также ее соль, с образованием уксусной кислоты и различных количеств масляной кислоты [16, 17, 18]. Выход масляной кислоты варьировал от нуля до значительных количеств, в зависимости от используемых бактерий. Разновидностью применяемой культуры объясняются, очевидно, многие противоречивые данные. В начале превращения пировиноградной кислоты образовывалась только уксусная кислота, а затем масляная, вероятно, из ацетоуксусной кислоты, получаемой при конденсации уксусной кислоты. Количество масляной кислоты возрастало до 50% от летучих кислот. Все штаммы бактерий давали также молочную кислоту. Присутствие фтористых соединений сокращало количество масляной и уксусной кислот, но увеличивало количество молочной кислоты. Мышьяк препятствовал образованию масляной, но не уксусной кислоты [17]. Из пировиноградной кислоты получали хорошие выходы продуктов ацетоно-бутилового брожения, когда применяли развивающуюся культуру [24. 28]. Такие же результаты были получены в присутствии калил и магния с применением суспензий клеток Clostridium acetobutylicum, что дало основание считать пировиноградную кислоту предшественником ацетона и бутанола в брожении [28]. Далее было показано, что калий и магний способствуют образованию ацетона из пировиноградной кислоты и превращению последней в энольную форму 2-фосфопировиноградной кислоты [25]. Этот продукт фосфорилирования считают возможным промежуточным продуктом ацетоно-бутилового брожения. Он сбраживался суспензией клеток с образованием ацетона, бутанола и масляной кислоты. Из энольной формы фосфопировиноградной кислоты было получено в 2,6 раза больше бутанола, чем из пировиноградной кислоты [2, 25, 29]. Розенфельд и Симон [29] считают, что сбраживание энольной формы фосфопировиноградной кислоты суспензиями Clostridium acetobutylicum от ацетона и бутанола открывает новые возможности рассмотрения механизма ацетоно-бутилового брожения. Авторы предполагают возможность двух последовательных рядов превращений, ведущих к реакциям конденсации:
Кепселл и Джонсон [24] показали, что экстракт Clostridium butylicum сбраживает пировиноградную кислоту: СН3СОСООН + Н2О -» СН3СООН + СО2+ Н2. Данная реакция является промежуточной при образовании ацетилфосфата [35]: СН3СОСООН + РО4Н3 -» СН3СООРО3Н2 + СO2 + Н2 Когэн и Когэн-Базир [18], основываясь на литературных данных [24, 30, 32, 35] и на собственных исследованиях, считают, что уксусная кислота (ацетилфосфат) является первым продуктом разложения пировиноградной кислоты суспензией маслянокислых или ацегоно-бутиловых бактерий. Уксусный альдегид СН3СН. При ацетоно-бутиловом брожении не обнаружен, но при добавлении в сбраживаемую среду сбраживался бактериями с образованием растворителей [9]. Доказательством существования уксусного альдегида Нейберг считает наличие ацетилметилкарбинола, который образуется из двух молекул уксусного альдегида путем соединения альдегидных групп [37]. На это указывают и другие авторы, считая даже образование уксусной кислоты и ацетона свидетельством наличия уксусного альдегида, как промежуточного продукта брожения [23]. Бернгауэр и Кюршнер [14] показали, что более 60% вводимого уксусного альдегида превращалось активными ацетоно-бутиловыми бактериями в бутанол. Менее активные культуры превращали в бутанол 10—21% уксусного альдегида, а 60—70%—в другие продукты брожения, главным образом в этанол. Различные способы обнаружения уксусного альдегида в ацетоно-бутиловой бражке (прибавление Na- и Са-сульфита, древесного угля и др.) не дали положительных результатов, в то время как при других брожениях удавалось этими способами связать уксусный альдегид [27]. Он был обнаружен Нейбергом [26] при сбраживании углеводов бактериями Bacilius butylicus. В настоящее время доказано, что ,в процессе образования ацетилированной формы кофермента А (см. стр. 200) происходит декарбокоилирование пировиноградной кислоты и образуется комплексное соединение уксусного альдегида с простетической группой декарбоксилазы, которой является дифосфотиамин (ДФТ) [3]. Возможно, что этим объясняются неудавшиеся попытки обнаружить уксусный альдегид в процессе ацетоно-бутилового брожения при помощи связывающих его веществ. Из рассмотренных промежуточных продуктов спиртового брожения только пировиноградную кислоту и уксусный альдегид можно считать промежуточными продуктами ацетоно-бутилового брожения. Приведенные данные говорят о том, что характер распада гексоз в ацетоно-бутиловом и спиртовом брожениях, по-видимому, различен. В числе возможных промежуточных продуктов ацетоно-бутилового брожения были исследованы также следующие вещества. Метилглиоксаль СН3—СО—СНО, альдегид пировиноградной кислоты. Не обнаружен при ацетоно-бутиловом брожении [27], на него не действовали суспензии клеток бактерий [20]. Токсичен [8]. Присутствие 0,03% метилглиоксаля в заторе сильно тормозило брожение [23]. Метилглиоксаль в виде гидратной формы предполагается в качестве промежуточного продукта брожения по схемам Клюйвера, Петерсона и Фреда [5, 8]. Как уже было указано, мегилглиоксаль образовывался при сбражнвании ацетоно-бутиловыми бактериями гексозодифосфата [31], но при этом не образовывались нормальные продукты брожения. Муравьиная кислота НСООН. Обнаружена в процессе ацетоно-бутилового брожения. В первые 30 часов брожения количество ее было незначительно, а после падения общей кислотности возрастало, достигая 0,13 мл 0,1N раствора в 10 мл бражки [36]. По предположению В. Н. Шапошникова, основным восстанавливающим агентом в ацетоно-бутиловом брожении является муравьиная кислота. Изменения в соотношениях окисленных и восстановленных продуктов объясняются тем, что распад муравьиной кислоты на СО2 и Н2 происходит в разное время с неодинаковой скоростью [1]. Путем добавок даже небольших количеств муравьиной кислоты в процессе ацетоно-бутилового брожения повышался выход бутилового и этилового спирта. Это подтверждает высокую активность НСООН как донатора водорода [1, 36]. Стайльз, Петерсон я Фред [36] вводили муравьиную кислоту в процессе сбраживания мучных заторов бактериями Cloridium acetobutylicum и обнаружили ее разрушение, что говорит в пользу гипотезы об образовании СОг и Н2 из муравьиной кислоты, как это предполагается в ряде схем химизма брожения. На 21—29-м часу брожения авторы вводили 0,17—1,25 г/л муравьиной кислоты, при этом 80—60% ее сбраживалось. При прибавлении мела во время брожения около 40% образующихся кислот, оставалось в виде кальциевых солей, в которых обнаружено 0,4% муравьиной, 42,1% уксусной и 57,5% масляной (по весу). По числу молей в процентах от всех летучих кислот муравьиная кислота составляла: «а 16—21-вд часах брожения 0,4% и на 64—69-м часах брожения 4,8—5,6%. Абсолютное количество муравьиной кислоты в конце брожения возрастало в 5—8 раз. Авторы предполагают, что муравьиная кислота в момент возникновения в процессе брожения очень лабильна и легко разрушается микроорганизмом. Отмытые клетки Cloridium acetobutylicum не действовали на натриевую соль муравьиной кислоты [2, 30]. Молочная кислота СН3—СНОН—СООН. Является если не промежуточным, то во всяком случае одним из конечных продуктов брожения. Спикман [33] показал, что нелетучая кислота, образующаяся из крахмала или сахара в процессе ацетоно-бутилового брожения, является молочной кислотой. В большинстве опытов при сбраживании различных Сахаров количество молочной кислоты составляло 1,0—1,2 мл 0,1 Л раствора в 10 мл бражки. Автор считает, что концентрация молочной кислоты в этих пределах токсична для бактерий. По схеме Спикмана молочная кислота распадается (декарбоксилируется и окисляется) на уксусную кислоту, СО2 и Н2. Молочная кислота, согласно этой схеме, является непосредственно продуктом распада сахара. Автор указывает на тесную связь образования молочной и уксусной кислот при брожении пентоз, в то время как при брожении гексоз молочная кислота образуется независимо от летучих кислот, в конце брожения. Следует, однако, отметить, что приведенные в работе данные не дают достаточных оснований для такого вывода. В опытах с отмытыми клетками Cloridium acetobutylicum [2, 16] было показано, что молочная кислота сбраживалась только в присутствии уксусной и масляной кислот. Увеличение концентрации уксусной кислоты и сохранение постоянной концентрации молочной кислоты приводило к увеличению содержания масляной кислоты. Образование последней тормозилось фтористыми и мышьяковистыми соединениями и гидроксил-амином. Суспензия отмытых клеток Cloridium acetobutylicum в присутствии СО2 сбраживает сахар в рацемическую молочную кислоту [31]. Методом меченых атомов показано, что Cloridium acetobutylicum способны утилизировать СО2 в глюкозном субстрате и образовывать молочную кислоту [4]. Прибавление молочной кислоты в процессе ацетоно-бутилового брожения приводило к увеличению выхода бутанола. Мы наблюдали это в условиях производства, когда в течение декады на брожение возвращалась бражка после молочнокислого закисания, содержание молочной кислоты в которой составляло 11,8 мл 0,1 N раствора на 10 мл, при общей кислотности 15,8 мл 0,1 N раствора на 10 мл. Бражку вводили в мучные заторы и совместно стерилизовали. В таком смешанном заторе содержалось 83 мг/л молочной кислоты. В этот период выход бутанола составлял 234,9 кг на 1 тонну крахмала, против обычного выхода на той же муке (221—223 кг), т. е. возрос на 6%. Уксусная кислота СН3СООН. Является промежуточным и конечным продуктом ацетоно-бутилового брожения. Как показал В. Н. Шапошников [11], в первой стадии двухфазного процесса брожения образуются летучие кислоты, главным образом уксусная и масляная, которые во второй стадии брожения потребляются бактериями с образованием растворителей. Добавление уксусной кислоты в процессе ацетоно-бутилового брожения приводит к увеличению выхода ацетона [20], но, по данным Спикмана, не оказывает никакого влияния на выход бутанола [8]. Такие же. результаты были получены и в наших опытах [7]. Уксусная кислота, вводимая при сбраживании глюкозы, на 90% превращалась в ацетон. В большинстве предложенных схем ацетоно-бутилового брожения уксусная кислота рассматривается как предшественник ацетона; считают, что образование ацетона идет через ацетоноуксусную кислоту, которая образуется путем конденсации двух молекул уксусной кислоты. По данным Бернгауэпэ и Кюршнера [14], уксусная кислота полностью превращалась в ацетон (97% от теоретического) активной культурой ацетоно-бутиловых бактерий. Ослабленная культура превращала в ацетон только около 30% уксусной кислоты, а около 70% ее — в этанол (этиловый спирт). По данным этих же авторов, на синтетической среде Спикмана с 1,5% глюкозы и 0,25% пептона уксусная кислота подавляла брожение. Возможно, что здесь сказывалось отсутствие буфера. Вуд, Броун и Веркман [38] показали, что при добавлении к бродящему кукурузному суслу уксусной кислоты, содержащей меченый углерод (СН3С13ООН), при брожении с Cloridium acetobutylicum и Cloridium butylicum наличие С13 было установлено в различных продуктах брожения: бутаноле, ацетоне, изопропиловом спирте, масляной и уксусной кислоте, этаноле и СО2. Бутиловый спирт содержал до 55% общего количества С13, примерно в равных соотношениях в карбонильной группе и в (5-положении. На основании этих данных было высказано предположение, что синтез бутанола происходит за счет уксусной кислоты или ее производных. Ацетон и изопропиловый спирт содержали 15—19% общего количества С13, который находился соответственно в карбонильной и карбинольной группах. Это соответствует предположению, что ацетон образуется при декарбоксилировании ацетоуксусной кислоты, синтезированной из уксусной. Не следует усматривать противоречия между приведенными данными (Вуд и др.) и результатами тех исследований, согласно которым уксусная кислота давала только прирост ацетона. Можно полагать, что вводимая уксусная кислота, превращаясь в ацетоуксусную, распределяется между ацетоном и бутанолом (как это будет показано в схеме брожения), но абсолютного прироста бутанола не происходит в связи с недостатком водорода, необходимого на восстановительные процессы. Общий прирост ацетона эквивалентен вводимой уксусной кислоте, фактически же он происходит как за счет вводимой, так и за счет образующейся при брожении уксусной кислоты. Дэвис [20] указывает, что одна уксусная кислота не дает заметного количества ацетона, когда инкубируется суспензией клеток ацетоно-бутиловых бактерий. Если, кроме уксусной кислоты, присутствует пировиноградная кислота или глюкоза, тогда образуется большое количество ацетона. Автор считает, что распад пировиноградной кислоты до уксусной кислоты дает энергию для конденсации уксусной кислоты в ацетоуксусную. По его мнению, механизм образования ацетона еще остается неразрешенным, но разрешение это должно включить и пировиноградную и уксусную кислоты вместе. Баркер и сотрудники [13, 15, 34] показали, что уксусная кислота и этиловый спирт конденсируются суспензией клеток С1. butylicum в масляную кислоту. Эти превращения представляют собой окислительно-восстановительный процесс, в котором этанол окисляется в двууглеродное соединение, названное авторами «активный ацетат», находящееся в равновесии с уксусной кислотой. «Активный ацетат» конденсируется с уксусной кислотой в соединение с 4 атомами углерода, которое служит окислителем в реакции и восстанавливается в масляную кислоту согласно схеме: —4Н уксусная кислота +4Н Этанол —— Активный ацетат ——————— С4 соединение —— Масляная кислота уксусная кислота
Это положение в некоторой мере согласуется с предположением Вуда и др. [38] о том, что синтез бутанола происходит за счет уксусной кислоты или ее производных. Дальнейшими исследованиями было доказано, что «активный ацетат» представляет собой ацетилированную форму кофермента А(СН2СОSКоА) [3, 6, 13]. Ацетоуксусная кислота СН3—СО—СН2—СООН. Является промежуточным продуктом ацетоно-бутилового брожения. Она обнаружена при брожении в период максимальной скорости образования растворителей. Быстро декарбоксилировалась до ацетата суспензией клеток при оптимуме рН 4,3 [20]. Дэвисом [21 был выделен фермент — декарбоксилаза ацетоуксусной кислоты,— который действует в аэробных и анаэробных условиях, имеет оптимальную активность при рН 5,0, устойчив к обработке ацетоном, хорошо сохраняет свою активность в виде ацетонового порошка. По Липману [34], с термодинамической точки зрения переход уксусной кислоты в ацетоуксусную представляется следующим образом: СН3СООРО3Н2 + СНзСООН — СН3СОСН2СООН + Н3Р04. Ацетоуксусная кислота, прибавленная к бродящей культуре, быстро отщепляла СО2, превращаясь в ацетон [23]. На ацетоуксусную кислоту различные штаммы организмов действовали различно. Одни давали только уксусную кислоту, другие — уксусную и масляную. Ацетоуксусная кислота восстанавливалась до масляной кислоты в присутствии молочной или пировиноградной кислот [2. 18]. Когэн и Когэн-Базир [18] показали, что в противоположность Cl. kluyveri суспензия ацетоно-бутиловых бактерий может восстанавливать ацетоуксусную кислоту в масляную. Авторы считают, что анетоуксусная кислота, возможно, является промежуточным продуктом в синтезе масляной кислоты из пировиноградной. Ацетопировиноградная кислота СН3—СО—СН2—СО—СООН. Не затрагивалась суспензией клеток ацетоно-бутиловых бактерий и даже в концентрациях 1/3000 моля угнетала брожение глюкозы, кукурузного затора и пировиноградной кислоты [20]. По схеме Кребса и Джонсона (1937 г.) ацетон образуется из ацетоуксусной кислоты через ацетопировиноградную кислоту: СНзСОСООН + СНзСООН — СН3СОСН2СОСООН + Н2О — СН3СОСН2СООН + CO2 + H2
Встречается, однако, указание, что вещество, содержащее в середине углеродной цепи группировку —СО—СН2—СО—, не может пройти через клеточную стенку [20], Именно этим Дэвис объясняет невозможность функционирования ацетопировиноградной кислоты в качестве предшественника ацетона, а не тем, что она подавляет рост и брожение, так как в брожении могут участвовать какие-либо ее фосфорилированные формы [20]. Этот же автор в другой работе [21] указывает, что ацетопировиноградная кислота уже при концентрации М 106 сильно подавляет декарбоксилазу ацетоуксусной кислоты, что полностью исключает возможность существования ее как промежуточного продукта брожения. Структурное соотношение между ацетопировиноградной и ацетоуксусной кислотами вызывает предположение, что подавление носит конкурирующий характер. β-гидрооксимасляная кислота СНзCНОНСH2СООН. Предполагается промежуточным продуктом брожения по схеме Шена [12]. (3-гидрооксимасляная кислота, прибавленная к бродящей культуре, не оказывала тормозящего действия на брожение и не была токсичной для бактерий, но при этом не наблюдалось повышения количества продуктов брожения, что давало основание считать ее несбраживаемой [14, 23]. β-гидрооксимасляная кислота не затрагивалась суспензиями клеток ацетоно-бутиловых бактерий [20]. Следует, правда, отметить, что в условиях этих опытов и масляная кислота не затрагивалась суспензией клеток; следовательно, эти данные не свидетельствуют о ее несбраживаемости. Более поздними исследованиями [18, 2] было показано, что β-гидрооксимасляная кислота превращалась отмытыми клетками Clostridium acetobutylicum в ацетон, уксусную и масляную кислоты. При этом предлагается следующая схема: 2СН3СНОНСН 2СООН — 2СН2СОСН2СООН + 4Н ;СН3СОСН 2СООН + Н2О — 2СН3СООН;СН3СОСН3СООН + 4Н — СН3СН2СН2СООН + Н2О; или общая реакция: 2СН3СНОНСН 2СООН — СН3СН2СН2СООН + 2СН3СООН.Мышьяк препятствовал восстановлению р-оксимасляной кислоты до ацетоуксусной в присутствии молочной кислоты; так же действовали фтористые соединения, однако последние не тормозили реакцию восстановления р-оксимасляной кислоты в том случае, когда вместо молочной кислоты в качестве восстановителя применялась пировиноградная кислота [18]. Альдоль, или Ацетальдоль, СН3—СНОН—СН 2—-ОНО, альдегид β-гидрооксимасляной кислоты. Фигурирует во всех предложенных схемах брожения как предшественник масляной кислоты или бутанола. Считают даже более вероятным образование бутанола непосредственно из альдоля и лишь отчасти — из масляной кислоты (схема В. Н. Шапошникова [1]).Однако экспериментальных подтверждений эти предположения пока не нашли. Альдоль не обнаружен при ацетоно-бутиловом брожении [27]. В своей обычной форме он токсичен для ацетоно-бутиловых бактерий [23,8]. Другие исследователи указывают, что в испытанных концентрациях, от 0,088 до 0,176%, альдоль не оказывал вредного влияния на брожение, но и не давал повышения выходов продуктов брожения [14].
Кротоновый альдегид СН3—СН=СН—СНО. Является предполагаемым промежуточным продуктом по схеме Клюйвера. Оказался очень ядовитым для ацетоно-бутиловых бактерии; в количестве 0,036% он тотчас же останавливал сильноидущее брожение [14]. Следует, однако, иметь в виду, что тот или иной промежуточный продукт, будучи токсичен в свободном виде, может нормально переноситься бактериями в связанном состоянии с фосфатом или с коферментом А. Кротоновая кислота СН3—СН = СН—СООН. Сбраживаласъ активной культурой в бутанол и ацетон [14]. Так, в трех опытах перешло в бутанол 24, 63 и 17% введенной кротоновой кислоты и в ацетон соответственно 50, 33 и 37%. Указание относительно обнаружения в экстрактах Clostridium acetobutylicum ферментной активности, свойственной кротоназе, (3-гидрооксимасляно кислой дегидрогеназе и тиолазе [13, 35], может свидетельствовать о том, что кротоновая кислота, 6-гидрооксимасляная кислота и ацетоуксусная кислота являются промежуточными продуктами ацетоно-бутилового брожения. Масляная кислота СНзСН2СН2СООН. Является промежуточным и конечным продуктом брожения. Наличие масляной кислоты было установлено почти во всех брожениях, ведущих к образованию бутанола Добавление масляной кислоты к суслу увеличивало выход бутанола [33]. Бернгауэр и Кюршнер [14] показали, что активная культура ацетоно-бутпловых бактерий восстанавливала прибавленную масляную кислоту почти целиком в бутанол (более 90%), а ослабленная культура — только на 36%; при этом около 50% масляной кислоты оставалось несброженной. После активизации культуры путем последовательных пересевов на затор с мелом и без мела она опять полностью восстанавливала масляную кислоту в бутанол (до 98%). Вуд, Броун и Веркман [38] в процессе сбраживания кукурузного затора бактериями Clostridium acetobutylicum и Cloridium butylicum вводили масляную кислоту, меченую тяжелым углеродом (СН3С13Н2СН2С13ООН); при этом наличие С13 было установлено в основном в бутаноле (84%), в масляной кислоте бражки (13%) и частично в других продуктах брожения. Эти данные подтверждают предположение, что масляная кислота является предшественником бутанола. Превращение масляной кислоты в уксусную кислоту, ацетон и изопропиловый спирт, по мнению авторов, является следствием обратимой серии реакций, общим промежуточным звеном которой является ацетоуксусная кислота. По схеме Спикмана [33], масляная кислота образуется совместно с уксусной непосредственно при распаде молекулы гексоз. В процессе брожения масляная кислота исчезает из сусла быстрее, чем уксусная кислота[8]. Используя отмытые клетки Clostridium acetobutylicum, Симон [30, 2] показал, что там, где альдегидная группа глюкозы была заменена СООН или СН2ОН, или был введен фосфат (эфир Кори), в качестве продукта метаболизма была получена масляная кислота. Однако видоизменение у шестого углеродного атома глюкозы (т. е. галактуроновая кислота) — приводило к образованию уксусной кислоты. Согласно исследованиям Дэвиса [20], масляная кислота восстанавливалась до бутанола суспензией клеток в присутствии глюкозы, но не в присутствии пировиноградной кислоты. Автор делает вывод, что глюкоза или какой-то близко к ней относящийся продукт, возможно триозо-фосфат, является восстанавливающим агентом для масляной кислоты. При этом предлагаются следующие уравнения: С6Н12O6 + С3Н7СООН — 2СН3СОСООН + С4Н2ОН + Н20; пировиноградная кислота, которая при этом образуется, будет затем сбраживаться до уксусной кислоты: СН3СОСООН + Н2О — СНзСООН + СО2 + Н2; или суммарное уравнение: С6Н12О6 + С3Н7СООН + Н2О — 2СН3СООН + 2СО2 + 2Н2+ С4Н9ОН. Выдвигаемое Дэвисом положение, что масляная кислота может быть восстановлена до бутанола только в присутствии глюкозы, на наш взгляд, недостаточно обосновано. Так, например, мы сбраживали маслянокислый кальций на среде с ксилозой. По всей вероятности для этого необходимы нормальные условия любого процесса брожения, что обеспечивает взаимосвязь продуктов брожения, сохранение определенных равновесий, накопление нужных ферментных систем и источников энергии. При этих условиях может быть сброжена вводимая масляная кислота (восстановлена до бутанола), которая не сбраживалась суспензией клеток. При сбраживании маслянокислого кальция анионы масляной кислоты почти полностью потреблялись бактериями (до 70% их переходило в бутанол). В остатке кальциевой соли анион масляной кислоты в процессе брожения замещался анионом уксусной кислоты [7]. Масляный альдегид СНзСН2СН2СНО. Предполагается в качестве промежуточного продукта брожения по схеме Спикмана [33]. По данным Бернгауэра и Кюршнера [14], альдегид масляной кислоты, будучи введен в кукурузный затор, сбраживаемый ацетоно-бутиловыми бактериями, превращался ими главным образом в бутанол и частично в ацетон. Так, по данным трех опытов авторов, в бутанол перешло 72, 71 и 96% масляного альдегида и в ацетон соответственно — 17, 25 и 2%. Выводы На основании литературных данных рассмотрены возможные и предполагаемые промежуточные продукты ацетоно-бутилового брожения. К числу установленных прямым или косвенным путем промежуточных продуктов брожения могут быть отнесены: уксусная, масляная и муравьиная кислоты, которые выделены также в числе конечных продуктов брожения; пировиноградная кислота, уксусный альдегид, ацетилфосфат, ацетоуксусная кислота, р-оксимасляная кислота, кротоновая кислота и масляный альдегид. С меньшей достоверностью можно считать промежуточными продуктами брожения альдоль, кротоновый альдегид и молочную кислоту; последняя является также одним из конечных продуктов брожения.
II. ДИНАМИКА И БАЛАНС ПРОДУКТОВ АЦЕТОНО-БУТИЛОВОГО БРОЖЕНИЯ. СХЕМА СБРАЖИВАНИЯ.
Б.М. Нахманович провел исследования динамики и баланса ацетоно-бутилового брожения. Опыты проводились им почти исключительно на крахмалистых средах (кукурузный затор) [1, 30] или на глюкозе [14]. Основные результаты этих исследований приведены в общих руководствах по ацетоно-бутиловому брожению [4, 14, 15] и широко известны. При этом было показано [1], что скорость окислительных процессов незначительно менялась на протяжении всего периода брожения. Восстановительные же процессы постепенно ускорялись, достигая наибольшей интенсивности в начале второй фазы брожения, что совпадало с максимальным количеством бактерий в среде. Конечное соотношение растворителей составило ацетон + бутанол + этанол = 32—34% + 60—61% + 3—10% , соответственно. Соотношения растворителей менялись в зависимости от степени восстановленности сбраживаемого субстрата [25]. При сбраживании маннита, более восстановленного продукта, чем глюкоза, увеличивался выход бутанола. Среднее соотношение растворителей составляло 11,6 : 82,0 : 6,4 (в том же порядке). При сбраживании глюконата кальция, более окисленного продукта, чем глюкоза, соотношение растворителей сдвигалось в сторону ацетона и составляло 60 : 24 : 16. В этой же работе был показан окислительный характер брожения арабинозы. Сбраживание пентоз ацетоно-бутиловыми бактериями изучено очень слабо, разноречивы даже мнения о степени их сбраживаемости. Робинсон [31], изучавший ацетоно-бутиловое брожение на различных углеводах, относит ксилозу и арабинозу - продукты переработки целлюлозы древесины, в противоположность глюкозе, фруктозе и сахарозе, к группе углеводов ненормального брожения, при котором сахара потребляются неполностью, а кислотность останавливается на высшей точке. В опытах Андеркофлера, Христенсена и Фульмера [36] ксилозой (продуктом гидролиза целлюлозы древесины) удавалось заменить только 40% кукурузной муки без снижения выходов и скорости брожения, в то время как глюкозой и сахарозой можно было заменить до 80% муки. Однако другие исследователи [29, 24] показали, что ксилоза и арабиноза нормально и полностью сбраживаются ацетоно-бутиловыми бактериями. Это подтверждается и нашими исследованиями [10]. Изучая вопросы замены пищевого сырья в ацетоно-бутиловом производстве и имея в виду использовать в качестве заменителей муки пентозные гидролизаты кукурузной кочерыжки и других растительных отходов [7, 8, 10, 12], мы считали необходимым исследовать динамику сбраживания ксилозы и арабинозы, как продуктов переработки целлюлозы древесины, сравнительно с динамикой сбраживания крахмала. Такое направление исследований соответствует положению, выдвигаемому В. Н. Шапошниковым, «что правильное представление о характере и путях превращения веществ (например, углеводов) в развивающихся культурах можно получить лишь путем детального изучения динамики их в процессе развития культуры» [16].
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ При сбраживании исследуемых Сахаров применялась среда, содержащая в 100 мл 4 грамма сахара (в пересчете на чистые монозы), 2 г кукурузного глютена и следующие соли: К2НРО4—50 мг, КН2РО4—50 мг. МgSО4—20 мг, NaС1—2 мг, Fе2SО4—1 мг, МnSО4—1 мг. Среды, простерилизованные при 112° в течение 30 минут, инокулировали (засевали) 3% чистой производственной культуры и сбраживали при 37°С. Через определенные промежутки времени отбирали пробы, в которых определяли: редуцирующие вещества РВ (по Бертрану1), растворители (но разработанному нами методу [9]), летучие кислоты (по Бехтеревой и Иерусалимскому [2]), общую кислотность и число бактериальных клеток в 1 мл среды. Для определения количеств газов, образующихся при Ацетоно-бутиловом брожении (СО2 и Н2) нами был разработан простой объемно-весовой метод. Определяя вес и объем суммы выделенных газов, рассчитывали содержание в смеси углекислоты и водорода. Так как 1 г-моль газа при нормальных условиях (0° и 760 мм рт. ст.) занимает объем 22,4 л, то 2 г Н2 —22,4 л; 1 г Н2—11,2 л; 44 г СО3 — 22,4 л; 1 г СО2 — 0,51 л.Выражая Н2 и СО2 в весовых единицах (г), можем написать следующие два уравнения: Н2 + СО2 = а.(суммарный вес в г); 11,2Н2 + 0,51СО2 = V (суммарный объем в л). 1 Для осахаривания крахмала — после трехчасового гидролиза 2%-ной кислотой НС1 при 100°. Решая уравнения (1) и (2) относительно интересующих нас неизвестных (Н2 и СО2), получим
СО2 = 11,2а — V / 10,69 Н2 = а — СО2. Вес выделившихся при ацетоно-бутиловом брожении газов (а) определяли по уменьшению веса сбраживаемых сред (опытных склянок). Для учета объема газов (5) их направляли в процессе брожения в мерные цилиндры (газгольдеры). Объем газов приводили к нормальным условиям.
Динамика и балансы ацетоно-бутилового броженияРезультаты одного из опытов по определению динамики сбраживания крахмала приведены в табл. 1. Таблица 1 Динамика и баланс продуктов при ацетоно-бутиловом сбраживании крахмала (в мг-молях/л)
Содержание углерода в продуктах брожения хорошо балансировалось с углеродом сброженного сахара, начиная с 24 часов брожения. На 12-м часу брожения такой баланс показал наличие неучтенных промежуточных продуктов, в которых содержалось около 20% углерода сброженного сахара. В то же время количество выделившегося водорода было значительно меньше расчетного (соответственно 105 и 165 мг-молей/л. Количество выделившегося углекислого газа на всех стадиях брожения хорошо совпадало с расчетным. Данные по составлению балансов ацетоно-бутилового брожения на крахмале, глюкозе и сахарозе свидетельствуют о следующих средних количественных соотношениях продуктов при сбраживании гексоз:
При этом четырехуглеродные продукты (бутанол и масляная кислота) составляют 50% сброженного сахара (в молях), трехуглеродные (ацетон) — 33,3%, двууглеродные (этанол и уксусная кислота) — 33,3% и одноуглеродные (СО2) — 233,3%. В большинстве опытов за счет снижения выхода С2 возрастал выход С3 и С 4. Так, для приведенного опыта: С4 = 54,5%; С3 = 36,8%; С2 = 54,5%; С1 = 36,8%. Однако наблюдалось и обратное явление, когда за счет снижения выхода бутанола резко возрастал выход этанола (см. таблица 5) Приведенная схема сбраживания арабинозы подтверждается следующими фактами: 1) накопление в первые часы брожения больших количеств уксусной кислоты; 2) число молей уксусной кислоты плюс удвоенное число молей ацетона на всех промежуточных стадиях брожения соответствовало числу молей сброженной арабинозы (см. табл. 3); 3) утроенное число молей бутанола на всех промежуточных стадиях брожения соответствовало числу молей сброженной арабинозы (см. табл. 3); 4) меньшее образование водорода и более окисленный характер брожения, чем при сбраживании ксилозы и гексоз. Однако водорода и углекислого газа при ацетоно-бутиловом сбраживании образуется фактически больше, чем должно было быть в соответствии с предполагаемой схемой. Возможно, что недостаток водорода при сбраживании арабинозы компенсируется бактериями за счет частичного окисления гликолевого альдегида или ацетилфосфата. Такое предположение высказывалось ранее {25} и оно представляется вполне вероятным. Наряду с этим должно образоваться также дополнительное количество углекислого газа, что показано на схеме.
ЛИТЕРАТУРА 1.0. Отъёмно-доливное культивирование микроорганизмов - продуцентов бутанола. 1. Отходы ацетоно-бутилового производства. Ацетоно-бутиловая барда. 1.A. Купить штамм бактерий Clostridium acetobutylicum для производства биобутанола. 2. М. Н. Бехтерева и Н. Д. Иерусалимский, «Микробиология», т. 5, вып. 6, 1936, 777. 3. Бродильные производства, т. I, ч. III, Ацетоно-бутиловое брожение (У. Н. Маккатчен и Р. Дж, Хиккей), Пищепромиздат, 1959. 4. А. Клюйвер и К. Ван-Нил, Вклад микробов в биологию, ИЛ, М., 1959. 5. А. С. Коникова и М. Г. Крицман, «Микробиология», т. 22, вып. 1, 1951. 6. И. С. Логоткин. Технология ацетоно-бутилового производства, Пищепромиздат, 1958. 7. Д. М. Михлкн, Биологическое окисление, изд. АН СССР, М., 1956. 8. Б. М. Нахманович и Н. А. Щеблыкина, «Микробиология», т. 29, вып. 1, 1960, 67. 9. С. Преек от и С. Дэн, Техническая микробиология, гл. XII, Ацетоно-бутиловое брожение, ИЛ, М., 1952. 10. X. Ф. Смис и В. Л. .Обольд, Промышленная микробиология, гл. 9, Ацетоно-бутиловое брожение, Снабтехиздат, 1933. 11. М. Стефенсон, Метаболизм бактерий, ИЛ, М., 1951. 12. В. Н. Шапошников, Техническая микробиология, гл. XXIX, Ацетоно-бутиловое брожение, М., 1948. 13. М. М. Шен, Успехи биологической химии, вып. V, 1927.
|
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
микроорганизмами, дающими бутиловый спирт (биобутанол) и
ацетон в несколько иных соотношениях, является весьма сложным и интересным
биохимическим процессом.
