Фермент Глюкозоизомераза и ее применение в производстве глюкозно-фруктозного сиропа из крахмала

В пищевой промыщленности глюкозно-фруктозным сиропом ГФС, получаемым при ферментативном гидролизе крахмалсодержащего сырья с последующей частичной изомеризацией глюкозы во фруктозу с помощью глюкозоизомеразы (ГИ) часто заменяют сахар.

Глюкозно-фруктозный сироп (ГФС) оказался одним из наиболее перспективных среди довольно большого количества сахарозаменителей, применяемых в пищевой промышленности за рубежом. Глюкозно-фруктозный сироп широко признан на мировом рынке, так как по своим свойствам (сладость, пищевая ценность и др.) он конкурирует со свекловичным и тростниковым сахаром [7].

Производство глюкозно-фруктозного сиропа ГФС эффективней свеклосахарного, что обусловлено меньшими затратами труда на выращивание сырья (в основном кукурузы) и возможностью круглогодичной переработки его с получением дополнительных побочных продуктов (кукурузное масло, корма) [4]. Однако кукуруза и другое крахмалсодержащее сырье сами по себе представляют большую пищевую ценность. Поэтому проводятся исследования по использованию в производстве глюкозо-фруктозного сиропа целлюлозосодержащего сырья, в частности несортового хлопка, отходов древесины и др.

В настоящее время производство ГФС в основном сосредоточено в США. Значительное количество глюкозно-фруктозного сиропа выпускают в Японии, Канаде, Южной Корее, Аргентине, Испании, Югославии, Финляндии и др. [7].

В глюкозно-фруктозном сиропе содержится 42 либо 55 % фруктозы. В ряде стран уже налажено производство сиропа с содержанием фруктозы 90 % [4].

В России тоже осваивается производство глюкозно-фруктозного сиропа ГФС, получены первые опытные партии.

Известно, что производство глюкозно-фруктозного сиропа рентабельно только с применением иммобилизованной глюкозоизомеразы (ГИ). При этом для иммобилизации используют как клетки продуцентов, так и растворимый фермент [7]. Используемая в разных странах глюкозоизомераза (ГИ) принадлежит к классу изомераз, подклассу внутримолекулярных оксидоредуктаз. Ее истинное название — D-ксилоза кетол-изомераза (КФ 5.3.1.5).

Среди ферментов этого класса известно еще 3 фермента, обладающих способностью изомеризовать D-глюкозу в D-фруктозу. Однако из-за большей термостабильности и того, что кофакторы этого фермента — только Со²⁺ и Мg²⁺, промышленное значение имеет D-ксилоза кетол-изомераза (ГИ).

Основные источники этого фермента — микроорганизмы. Подавляющее большинство продуцентов найдено среди грамположительных бактерий и стрептомицетов.

Поиск новых и работа по интенсификации биосинтеза глюкозоизомеразы (ГИ) у существующих продуцентов проводится исследователями разных стран. Продуктивность микроорганизмов по глюкозоизомеразе может быть повышена подбором оптимальных условий их культивирования, а также с использованием методов ступенчатой селекции, индуцированного мутагенеза и генной инженерии. Для бактериальных культур перспективно непрерывное культивирование [1, 10, 11].

Глюкозоизомераза (ГИ) — индуцибельный фермент. У большинства микроорганизмов он накапливается внутри клеток [1, 8, 10]. Но имеются культуры, продуцирующие внутри- и внеклеточные изомеразы. Для некоторых из них, таких, как Streptomyces olyvaceus 13—4 и др., доказана идентичность синтезируемых ими эндо- и экзоферментов. Противоположные данные получены Шринивазаном с соавторами, наблюдавшими значительные различия физико-химических и энзиматических свойств внутри- и внеклеточных глюкозоизомераз рода Chainia [12].

Для внутриклеточных глюкозоизомераз важно выявление локализации этих ферментов внутри клеток. Результаты изучения локализации глюкозоизомеразы Streptomyces albogriseolus 28—3 с использованием прямого иммунопероксидазного метода указывают на связь фермента со структурами клеточной стенки [5].

В области клеточной стенки и периплазматического пространства обычно расположены ферменты, выполняющие функцию превращения составных частей окружающей среды в необходимые для метаболизма соединения. Очевидно, что можно отнести и к глюкозоизомеразе, функционирование которой в клетках (совместно с пермеазами и киназами соответствующих сахаров) приводит к образованию ключевых продуктов метаболизма, таких, как D-глюкозо-6-фосфат и D-ксилоза-5-фосфат [1, 10].

Наибольший выход глюкозоизомеразы ГИ из клеток достигается при обработке их ультразвуком, разрушении биомассы под давлением или автолизе в присутствии различных добавок (детергенты, толуол, лизоцим, стрептолитин). Представляет интерес возможность выделения фермента глюкозоизомеразы из клеток действием на них иммобилизованными литическими ферментами микробного происхождения. Выделенную из биомассы глюкозоизомеразу (ГИ) очищают или иммобилизуют.

При частичной очистке используют тепловую или кислотную денапрации. фракционное осаждение органическими растворителями, сульфатом аммония, а также солями Мg²⁺ или Мn²⁺. Большинство исследователей для частичной очистки глюкозоизомеразы используют комбинации перечисленных методов [8, 9].

Необычный метод очистки и концентрирования фермента глюкозоизомеразы предложили Джонсон с соавторами [6]. Они впервые наблюдали эффект индуцированной проницаемости полисульфоновых ультрафильтрационных мембран для глюкозоизомеразы, обработанной 0,1 -0,5 М раствором какой-либо соли (К⁺, Na⁺, NH4⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, или Co²⁺ соли соляной, серной, азотной, уксусной, лимонной или малеиновой кислот). Без добавки солей в ферментный раствор мембраны не пропускали молекулы изомеразы. Это явление пока не объяснено. Метод простой и эффективный.

Несмотря на большое количество частично очищенных глюкозоизомераз ГИ, выделенных изразличных микроорганизмов, до гомогенного состояния очищены ферменты не более чем 20 продуцентов. Для получения изомеразы в гомогенном состоянии частично очищенные препараты подвергают дальнейшему фракционирования методоми ионообменной хроматографии, гель-хроматографии, позволяющие проводить очистку фермента всего в 1-2 стадии. Например, при помощи имунноафинной хроматографии впервые глюкозоизомеразу Streptomyces albogriseolus 28-3 удалось очистить до гомогенного состояния в 1 стадию. Выход ферментной активности при этом составил 71%.

С использованием высокоочищенных ферментных препаратов глюкозоизомеразы исследован механизм действия фермента, его физико-химические свойства и кинетические свойства.

Как и у других термостабильных ферментов в молекуле большинства ГИ присутствуют преимущественно остатки аргинина, глицина и группы, образующие а-спираль (аланин, лейцин, глутаминовая кислота и аспаргин). В тоже время наблюдается пониженное содержание остатков цистеина, серина и лизина.

Особенность многих термостабильных внутриклеточных ферментов - пониженое содержание или полное отсутствие цистеина. Это объясняется восстановительной способностью внутриклеточной среды, сводящей к минимуму окислительные процессы.

Для многих ферментов с низким содержанием цистеина, в том числе для глюкозоизомеразы ГИ, кофакторы - мультивалентные ионы. В связи с этим высказывается предположение о возможности образования ионами металлов в таких белках внутримолекулярных поперечных связей, аналогичных по функциям дисульфитным мостикам.

Необходимо отметить, что глюкозоизомераза ГИ - это исключение из общей закономерности, согласно которой между термоустойчивостью ферментов и температурой выращивания продуцирующих их микроорганизмов существует строгая корреляция. Как и для ряда термостабильных ферментов мезофильных грибов, для глюкозоизомеразы этот факт можно объяснить существованием нескольких конформационных состояний. Одному или некоторым из них при повышенной температуре свойственна большая стабильность. Происходящие при этом структурные перестройки не затрагивают экранируемый активный центр изомеразы и его микроокружение, благодаря чему фермент обладает способностью катализировать реакции изомеризации при повышенной температуре.

Глюкозоизомераза ГИ обладает групповой специфичностью. Фермент может изомеризовать в основном два субстрата: D-глюкозу и D-ксилозу; в меньшей степени— D-рибозу, а также D-арабинозу, D-аллозу, D-рамнозу и L-арабинозу. Наибольшую степень сродства ГИ проявляет к D-ксилозе, хотя известны случаи, когда изомераза за обнаруживает почти одинаковое сродство как к D-ксилозе, так и к D-глюкозе [ 1, 4 ].

Глюкозоизомеразу ГИ выделенную из клеток, либо целые микробные клетки продуцентов подвергаю иммобилизации. Методы и носители, применяемые при иммобилизацпи и клеток и фермента, аналогичны и очень разнообразны [ 2, 4, 10, 11].

В настоящее время в промышленном масштабе иммобилизованную глюкозоизомеразу ГИ производят в основном 8 зарубежных фирм. Из них 5 фирм выпускают препараты в виде иммобилизированных клеток и 3 фирмы предлагают гетерогенные биокатализаторы на основе частично очищенного фермента. Наибольшее распространение получили препараты фирмы Novo Industry, Gist Brocades, Miles Kali Chemi [1,4]

Интересны работы по совместной иммобилизации глюкоамилазы либо других глюкозидаз и глюкозоизомераз ГИ. Эти исследования открывают новое направление в получении фруктозы непосредственно из крахмала либо других глюканов.

В результате иммобилизации и фермента, и клеток показатель операционной стабильности ГИ при 60º С увеличивается в среднем на 2 порядка. (с 0,2 - 3,0 до 20 - 289,0 сут).

Данные литературы свидетельствуют об изменении и некоторых других свойств ГИ при иммобилизации. Направленность этих изменений зависит от свойств фермента и может быть установлена только экспериментально.

Обзор литературы свидетельствует о возможности дальнейшего совершенствования как способов получения глюкозоизомеразы ГИ, так и процесса ферментативной изомеризации глюкозы во фруктозу.