Производство амилолитического ферментного препарато Амилосубтилина - Aspergillus Niger на послеспиртовой барде спиртового завода.

Производство амилолитического ферментного препарата Амилосубтилина продуцента Aspergillus Niger (альфа-амилазы) на послеспиртовой барде выгодно для любого спиртового завода по нескольким причинам.

Стоимость импортных концентрированных ферментных препаратов для осахаривания зернового сусла на спиртовом заводе составляет 20 Евро за 1 литр фермента. Таким образом, для завода с производительностью 3000 Дал спирта в сутки расходы на приобретение импортных ферментных препаратов составляют от 10 000 000 руб/год до 40 000 000 руб/год

В статье показана возможность замены импортного фермента на фермент собственного производства, полученный непосредственно на спиртовом заводе. Средой для культивирования собственного фермента служит послеспиртовая барда. Технология производства собственного ферментного препарата на барде не имеет отходов , поскольку культуральная жидкость после выращивания на ней фермента, полностью используется в производстве спирта, что и позволит сохранить оборотные средства, а также получить конкурентное преимущество.

В Лаборатории ферментных препаратов Института биохимии им Баха разработана технология производства технических ферментов термостабильной α-амилазы и глюкоамилазы для промышленных процессов высокотемпературного разжижения и декстринизации крахмала при производстве спирта.

На схеме производства спирта из зерна можно видеть, что для разжижения крахмала в зерновом замесе достаточно применить лишь a-Амилазу (т.е. Амилосубтилин), а для осахаривания крахмала - Глюкоамилазу (т.е. Глюкавоморин) Технологическая схема производства спирта из зерна

Смотри также Производство глюкоамилазы ( Глюкавоморина ) на послеспиртовой барде

В связи с тем, что многие спиртовые заводы, перерабатывающие зерно и картофель, переходят на совместную переработку зерна и патоки, также представляло интерес проверить возможность развития плесневых грибов на смешанной барде и определить активность образующихся амилолитических ферментов.

Как пишет А. П. Смирнова, для получения смешанной зерновой и паточной барды на опытном заводе ЦНИИСПа в г.Мичуринске Тамбовской области было проведено совместное сбраживание зерна и патоки. Патока была получена с Московского дрожжевого завода, содержала 48 % Сахаров и имела слабощелочную реакцию. На переработку было взято 200 кг нормальной ржи и 100 кг патоки. Патоку разбавляли до концентрации 28 % и подкисляли серной кислотой до О,Г. В период главного брожения зернового сусла в него при непрерывном продувании воздуха открывали приток сусла (доливной метод сбраживания). Температуру брожения поддерживали на уровне 30°. Брожение заканчивалось через 48 часов. Смешанная бражка имела видимый отброд 2,9 %, истинный отброд 5,3 % и кислотность 0,35.

Одновременно в дрожжанке было проведено брожение патоки той же партии, отогнан спирт и получена паточная послеспиртовая барда.

Паточная бражка имела видимый отброд 6,0°, истинный 9,2° и кислотность 0,35°.

Из ржаной бражки также была получена барда. Отброд ржаной бражки был равен 1,3%, истинный 3,8% и кислотность 0,25°.

На полученных образцах послеспиртовой барды, характеристика которых дана в табл. 1, был выращен глубинным способом плесневелый гриб Aspergillus Niger - продуцент альфа-амилазы, полученный методом вегетативной гибридизации [5]. Посев гриба был проведен мицелиальной культурой, выращенной на смешанной барде в течение 1 суток. На посев взято 10 % культуры гиба к объему питательной среды. Культивирование гриба проводилось на лабораторной качалке при температуре 30°. Срок роста культуры — 3 суток. К барде добавляли 0,2% магнезита. Как показали исследования, добавление к питательной среде магниевых солей создает оптимальную для роста гриба реакцию среды и повышает активность ферментов [2].

Таблица 1 Характеристика барды

Вид барды	Концентрация видимых сухих веществ в %	Кислотность	рН	Содержаний в г,100 мл
Вид барды	Концентрация видимых сухих веществ в %	Кислотность	рН	несброженного крахмала	мальтозы	Сахаров после гидролиза (РН)	Общего азота	растворимого азота
Зерновая (ржаная) .	3,8	0,62	4,2	0,210	^0,314	1,32	0,270	0,170
Смешанная (70% ржи и 30% патоки)	5,0	0,55	4,7	0,268	^0,178	1,032	0,280	0,200
Паточная	9,2	0,25 (летучих 0,038)	5,4	-	^-	0,586	0,364	-

Ежедневные наблюдения за ростом плесневелого гриба Aspergillus Niger позволили отметить замедленное развитие его на паточной барде. Так, через 24 часа роста во всех опытных колбах наблюдалось хорошее развитие мицелия, в то время как на паточной среде рост только намечался.

Как видно из данных табл. 2, активность амилолитических ферментов, получаемая при выращивании Aspergillus Niger S4 на ржаной барде смешанной и паточной, различается в основном по мальтазе (МС). МС у гриба, выращенного на паточной барде, значительно ниже, чем у выращенного на зерновой барде. Активность культуры гриба, полученной на смешанной барде, по мальтазе занимает среднее положение между культурами, выращенными на зерновой и паточной барде. Добавление 2 % муки к субстрату резко повышает активность амилазы и декстриназы, однако активность мальтазы при выращивании на паточной барде вдвое ниже но сравнению с зерновой.

Таблица 2. Влияние состава питательной среды на активность грибной культуры ASPERGILLUS NIGER S4

Среда	Рн	Концентрация сухих веществ в %	Активность ферментов в ед/100 мл
Среда	Рн	Концентрация сухих веществ в %	АС	дс	МС
Барда ржаная + 0,2% МgО	5,6	4,0	5	460	100
Барда ржаная + 0,2% МgО + 2 % муки	5,2	4,8	12	1140	320
Барда смешанная + 0,2% МgО	6,6	4,2	10	6'5	60
Барда смешанная + 0,2% МgО + 2% муки	5,6	6,3	20	1900	200
Барда паточная + 0,2% МgО	6,4	7,7	20	544	30
Барда паточная + 0,2% МgО +2 % муки	6,2	8,5	30	1600	150

Следующий опыт был проведен с выращиванием ASPERGILLUS NIGER S4 на субстратах, составленных смешиванием различных количеств ржаной и паточной послеспиртовой барды.

Культуру гриба анализировали через трое и четверо суток роста. Как видно из данных табл. 3, по мере снижения в субстрате количества зерновой барды и увеличения паточной активность мальтазы грибной культуры резко падает, а в варианте, где паточная барда составляет 70%, и на чисто паточной барде активность мальтазы вовсе отсутствует. Значительно ниже в этих вариантах и активность декстриназы.

Таблица 3 Влияние состава питател ной среды на активность амилолитических ферментов гриба Aspergillus Niger S4.

№	Состав среды	Продолжительность роста культуры в часах	Концентрация сухих веществ	рН	Сухой вес мицелия в г/100 мл	Активность ферментов в ед / 100 мл
№	Состав среды	Продолжительность роста культуры в часах	Концентрация сухих веществ	рН	Сухой вес мицелия в г/100 мл	АС	ДС	МС
1	Барда ржаная	72	2,6	5,0	1,7	6	450	115
1а	Барда ржаная	96	2,0	7,2	1,7	10	340	ПО
2	Барда ржаная 70% + паточная 30 %	72	3,8	6,5	1,85	5	340	20
2а	Барда ржаная 70% + паточная 30 %	96	3,9	7,5	1,8	9	340	20
3	Барда ржаная 60% + паточная 40%	72	4,0	6,8	1,9	5	840	20
За	Барда ржаная 60% + паточная 40%	96	4,4	8,0	1,6	6	250	20
4	Барда ржаная 50% + паточная 50%	72	4,8	7,2	1,85	5	440	5
4а	Барда ржаная 50% + паточная 50%	96	5,0	8,0	1,7	6	250	5
5	Барда ржаная 30% + паточная 70%	72	6,1	7,8	1,5	1	200	0
5а	Барда ржаная 30% + паточная 70%	96	6,0	8,4	1,75	4	200	0
6	Барда паточная	72	7,3	6,2	1,65	2	210	0
6а	Барда паточная	96	6,8	7,0	2,05	сл	160	0

В данном опыте питательная среда была засеяна суспензией конидий гриба, что, видимо, отразилось на общей активности амилолитических ферментов полученной культуры.

Мицелий гриба, окрашенный нейтральным красным, просматривали под микроскопом. Окрашивание мицелия гиба дает возможность наблюдать за структурными изменениями, происходящими в клетках гриба.

Отмечено, что при больших дозировках паточной барды в субстрате мицелий имеет укороченные гифы. Клетки мицелия более толстые, а вакуоли прокрашиваются в розовый и густо розовый цвет. Многие вакуоли плазмолизированы. Это явление характерно при недостатке кислорода в среде. Такое состояние мицелия наблюдалось нами ранее при выращивании гриба на упаренной барде [3]. В данном случае, видимо, растворимость кислорода в паточной барде, содержащей большое количество органических и солевых растворимых веществ, недостаточна. Следует отметить, что на одной барде без добавления муки срок роста гриба не должен быть выше трех суток. На четвертые сутки наступает автолиз мицелия, а в связи с этим повышение реакции среды (рН 7—8) и инактивация ферментов.

В следующем опыте в течение трех суток на различных вариантах смеси ржаной и паточной послеспиртовой барды выращивалась культура гриба ASPERGILLUS USAMII штамм 3. Этот штамм гриба был получен в нашей лаборатории облучением ASPERGILLUS USAMII ультрафиолетом и показал высокую активность амилолитических ферментов. В настоящее время он применяется для осахаривания сред на Гадовском спиртовом заводе. В смесь послеспиртовой барды добавляли магнезит и муку. Посев проводили суточной культурой мицелия, выращенной на ржаной спиртовой барде. Как видно из данных табл. 4, на всех вариантах среды была получена грибная культура с высокой активностью амилолитических ферментов. Особенно следует отметить наиболее высокую в варианте активность мальтазы на чисто паточной барде (с добавлением муки). Видимо, гриб ASPERGILLUS USAMII иначе реагирует на состав барды, чем штамм гриба Aspergillus Niger S4, так как при выращивании последнего на паточной барде получается либо культура с очень низкой активностью мальтазы, либо эта активность вовсе отсутствует. Полученные культуры гриба были использованы на осахаривание ржаных сред, которые готовили из 50 грамм муки.

Таблица 4 Влияние различных количеств паточной барды на активность амилолитических ферментов плесневелого гриба ASPERGILLUS USAMII штамм 3

	Состав среды	РН	Концентрация растворимых веществ в %	Активность ферментов в ед/100 мл
				АС	ДС	МС
				АС	ДС	МС
1	Барда ржаная + 2% муки + + 0,15% МgО	6,4	3,0	120	1500	500
2	Барда ржаная 70% + паточная 30% +2% муки + 0.15% Мg0	6,2	4,5	70	1700	645
3	Барда ржаная 60% + паточная 40% + 2% муки + 0,15% МgО	6,2	5,2	80	1650	600
4	Барда ржаная 50% + паточная 50% + 2% муки + 0,15 % МgО	6,2	5,2	30	1750	580
5	Барда ржаная 40% + паточная 60% + 2% муки + 0,15% МgО	6,1	6,3	60	1700	600
6	Барда паточная + 2% муки + 0,15% МgО	6,2	8,0	80	1700	680
7	Барда паточная + 3% муки + 0,15% МgО	6,0	8,2	120	1800	700

На осахаривание применяли 4 и 8 % культуры гриба к объему питательной среды. Брожение велось в течение трех суток. В качестве антисептика применяли раствор SO2 из расчета 250 мг/л среды.

В бражке определяли количество несброженных Сахаров и крахмала. Содержание, спирта определяли погружным рефрактометром и количество его рассчитывали на содержимое всей колбы, в которой подвергалось брожению 50 грамм муки.

Исходя из данных табл. 5 и судя по содержанию в бражке несброженных Сахаров и крахмала, можно видеть, что для полного осахаривания и брожения достаточно внесения 4 % грибной культуры, полученной на всех указанных вариантах среды. Однако при внесении на осахаривание 8 % грибной культуры выход спирта получается выше. Естественно, что в этом случае происходит более полный гидролиз других составных частей муки, помимо крахмала, и в первую очередь — гемицеллюлоз.

Таблица 5 Качество брожения зерновых заторов при осахаривании грибной культурой Aspergillus USAMII 3, выращенной на зерно-паточной барде

№	Активность ферментовв ед/100 лм			Внесено культуры на осахаривание в % к среде	Характеристика бражки
	Активность ферментовв ед/100 лм				Выделилось СО2 в г	отброд в %	кислотность в Д	Количество несброженных углеводов в г/100 мл			Количество спирта
	АС	ДС	МС					Количество несброженных углеводов в г/100 мл
	АС	ДС	МС					до гидролиза	после гидролиза (РВ)	крахмал
1	120	1500	500	8	15,6	0,5	0,23	0,955	1,34	0,14	16,2
2	70	1700	645	4	14,73	1,1	0,2	1,16	1,37	0,14	14,8
2а	70	1700	645	8	15,15	1,0	0,2	0,978	1,28	0,09	15,4
3	80	1650	600	4	14,82	1,2	0,22	1,40	1,34	0,17	14,7
За	80	1650	600	8	15,47	1,2	0,2	1,17	1,62	0,12	15,4
4	80	1750	580	4	14,2	1,0	0,2	1,03	1,34	0,17	14,4
4а	80	1750	580	8	15,6	0,6	0,25	0,902	1,15	0,12	15,4
5	60	1700	600	4	14,75	1,0	0,2	1,09	1,28	0,14	15,2
5а	60	1700	600	8	14,85	1,0	0,2	1,09	1,28	0,12	15,8
6	80	1700	680	4	14,9	1,0	0,21	0,99	1,26	0,12	15,7
6а	80	1700	680	8	15,15	0,5	0,2	0,87	1,25	0,12	16,1
7	120	1800	700	4	14,8	1,4	0,2	0,2	—	0,16	15,2
7а	120	1800	700	8	15,0	1,1	0,2	1,0	1,31	0,12	15,7

Таким образом, следует отметить, что на барде, полученной при совместном сбраживании зерна и патоки, а также на паточной барде можно получать грибную культуру, по активности амилазы и декстриназы равную культуре, выращенной на чисто зерновой барде. Активность грибной культуры резко возрастает при добавлении к барде 2% муки. Мальтазная активность плесневого гриба ASPERGILLUS NIGER S4 при культивировании его на паточной послеспиртовой барде и смешанной (зерно-паточной) низка или вовсе отсутствует.

Гриб Aspergillus UAMII штамм 3 выделяет активный комплекс амилолитических ферментов как на смешанной, так и на паточной барде, с добавлением муки и магнезита.

Выводы

1. Гриб Aspergillus Niger S4 нормально развивается на смешанной зерно-паточной барде, образуя ферменты амилазу и декстриназу, равные по активности грибной культуре, выращенной на зерновой барде.

На паточной барде обнаруживается задержка в развитии гриба.

2. Активность мальтазы у Aspergillus Niger S4, выращенного на смешанной послеспиртовоц барде, очень низка, на паточной после спиртовой барде она отсутствует вовсе.

3. При добавлении в смешанную барду муки активность ферментов грибной культуры возрастает как на чисто зерновой, так и паточной барде, однако активность мальтазы гриба, выращенного на паточной барде с добавлением муки, вдвое ниже по сравнению с культурой, выращиваемой на зерновой барде.

4. Гриб Aspergillus USAMII штамм 3 образует активный комплекс ферментов как на смешанной послеспиртовой барде, так и на паточной при добавлении 2% муки и 0,15% магнезита. 4% такой культуры достаточно для полного осахаривания зерновых сред.

Подробнее о выращивании см. нормы технологического проектирования здесь: ВНТП 34-93

Технологический процесс производства ферментов оптимизирован на базе НИИ Физиологии и биохимии микроорганизмов, г. Пущино..

Проектная и рабочая документация разработана Открытым акционерным обществом «Тамбовский завод «Комсомолец» имени Н. С. Артемова»...

Производство альфа-амилазы на Мариинском спиртовом комбинате в г. Кемерово

Расчет аппаратуры для производства глюкавоморина

Штамм Trichoderma reesei М18.2 способен к активному синтезу ксиланаз и целлюлаз на отходе спиртового производства - послеспиртовой барде. При глубинном культивировании на барде активность ксиланаз достигала максимум на четвертые сутки и составляла 530 и 3,3 МЕ/мл соответственно. Казанский университет. Ю.А.Морозова, Е.В.Скворцов, Ф.К.Алимова

ЛАБОРАТОРИЯ БИОТЕХНОЛОГИИ ФЕРМЕНТНОВ ИНСТИТУТА БИОХИМИИ ИМ. БАХА. Разработана технология производства технических ферментов термостабильной α-амилазы и глюкоамилазы для промышленных процессов высокотемпературного разжижения и декстринизации крахмала при производстве спирта. Разработана технология производства препаратов грибных (кислых) протеаз на основе высокоактивных мутантных штаммов-продуцентов Aspergillus oryzae для использования в производстве спирта, а также для получения белковых гидролизатов.