Увеличение выхода спирта при сбраживании пентоз

   Увеличить выход спирта при сбраживании пентоз ( ксилозы , арабинозы , рибозы ) осахаренных заторов можно

или используя смесь дрожжевых культур,

или используя биокатализатор для получения этанола из пентоз.

В современных промышленных процессах этанол получают микробиологическим способом ферментацией глюкозы с использованием клеток дрожжей в качестве биокатализаторов. В качестве источника глюкозы используют химические или ферментативные гидролизаты крахмало- или целлюлозосодержащих продуктов, отходов сельскохозяйственного или промышленного производства. Помимо глюкозы, они содержат до 25 г/л пентоз (ксилоза, арабиноза и рибоза), не сбраживаемых традиционно применяемыми в промышленности спиртовыми расами дрожжей. Для повышения экономической привлекательности процесса получения этанола из целлюлозосодержащего сырья целесообразно использовать биокатализаторы, обеспечивающие получение этанола из пентоз. В процессе разваривания зернового сырья и обработки его ферментными препаратами происходит гидролиз полисахаридов крахмала и получается гидролизный сахар в виде раствора (гидролизат). Содержащийся в гидролизате сахар состоит из гексозного (глюкоза, манноза и галактоза) и пентозного (ксилоза и арабиноза). Гексозный сахар используют на получение этилового спирта, а пентозный, не применяемый для получения спирта методом брожения, - для получения кормовых дрожжей. По такой комплексной схеме использования сырья работают многие спиртовые заводы , но при такой схеме пентозные сахара (ксилоза и арабиноза) не сбраживаются на спирт и переходят (теряются) в барду.

Букин, Немойтин, Блинков, Федоров и Попова провели серию опытов по сбраживанию гидролизатов (осахаренных заторов с разным содержанием гексозных и пентозных сахаров) смесью дрожжевых культур и установили увеличение выходы спирта.

Сусло с высоким содержанием ксилозы получали на основе гемицеллюлозной фракции гидролизата смеси лиственной и хвойной древесин. В него перед сбраживанием добавляли сульфат аммония и суперфосфатную вытяжку с целью достижения оптимальной концентрации в сусле 200-300 мг/л азота и 100-150 мг/л фосфора. Температура ферментации составляла 32^oС, pН 4,5-5,0, продолжительность ферментации 36 часов, выход этанола от использованных РВ составлял 32%.

Сущность способа переработки гидролизатов заключается в том, что в качестве растительного сырья для получения последних используют пивную дробину, которую подвергают гидролизу 1,0-3,0%-ной серной кислотой при 100-120^oС в течение 2-4 часов, после чего получают гидролизат с высоким содержанием ксилозы, из которого готовят сусло путем нейтрализации гидролизата известью и аммиаком до pН 4,5. Для сбраживания сахаров полученного сусла в этанол используют дрожжи Sacharomyces uvarum раса Ф-С-2, Candida sehata раса у-1632 и смесь этих культур. В процессе сбраживания поддерживают температуру 30-32^oС, pН 4,2-4,6, постоянное аэрирование осуществляют в течение 10 мин каждый час при расходе кислорода 10 литров/м3 жидкости.

Культура дрожжи Sacharomyces uvarum раса Ф-С-2 выделена при сбраживании гидролизатов сельхозотходов на спирт. Культура дрожжей Candida sehata раса у-1632 выделена при получении кормового белка на гидролизатах лиственной древесины [6].

Новизна способа в соответствии с изобретением заключается в применении нового растительного сырья, в котором содержится значительное количество гемицеллюлоз, из которых в результате гидролиза получают гидролизат, содержащий 86% пентозных сахаров, в том числе содержание ксилозы составляет 57%



Пример 1. В качестве исходного растительного сырья берут пивную дробину в соответствии с ТУ-10-5031536-135-90 в количестве 1 кг, помещают в варочную емкость объемом 5 литров, добавляют 25 г Н ₂O₄, в пересчете на моногидрат и 1,75 литров воды, создавая в смеси концентрацию варочной кислоты 1,0%. Гидролиз осуществляют при 120^oС в течение 2 ч при гидромодуле 10.

Гидролизат содержал следующие сахара, %:

пентозные сахара (ксилоза 1,86, арабиноза 0,95, рамноза 0,02),

гексозные сахара (гелактоза 0,34, глюкоза 0,08).

Общее содержание сахаров в гидролизате составляло 3,25%, при этом от суммарной концентрации сахаров количество ксилозы 57,1%, арабинозы 29,2%, рамнозы 0,6%, галактозы 10,5% и глюкозы 3,1%.

Характеристика гидролизата приведена в табл. 1.

Гидролизат при 80^oС нейтрализовали известью до pН 3,6, а затем аммиаком до pН 4,6, осадок отфильтровывали, а полученное сусло засевали дрожжевой культурой Sacharomyces uvarum раса Ф-С-2 до концентрации 20 г/л. В процессе сбраживания выдерживали температуру 30^oС, pН 4,2 и постоянное аэрирование 10 мин каждый час, длительность сбраживания составляла 36 часов. Определяли концентрацию сахаров и спирта бражке и рассчитывали выход этанола от сбраживаемых сахаров.

Результаты сбраживания сахаров приведены в табл. 2.

Пример 2. Аналогично примеру 1 в качестве исходного растительного сырья берут пивную дробину в соответствии с ТУ-10-5031536-135-90 в количестве 1 кг, помещают в пятилитровую варочную емкость, добавляют 75 г Н₂SO₄ в пересчете на моногидрат и 1,75 л воды, создавая в смеси концентрацию варочной кислоты 3,0%. Гидролиз осуществляют при 100^oС в течение 4 часов при гидромодуле 10.

Гидролизат содержал следующие сахара, %:

пентозные сахара (ксилоза 1,84, арабиноза 1,00, рамноза 0,01),

гексозные сахара (галактоза 0,32, глюкоза 0,06).

Общее содержание сахаров в гидролизате составляло 3,23%, при этом от общего количества сахаров в гидролизате концентрация ксилозы 57,0%, арабинозы 31,0%, рамнозы 0,3%, галактозы 9,9% и, глюкозы 1,8%. Характеристика гидролизата приведена в табл. 1.

Гидролизат при 80^oС нейтрализовали известью до рН 3,6, а затем аммиаком до pН 4,6, осадок отфильтровывали и полученное сусло засевали дрожжевой культурой Candida sehata раса ВКПМ у-1632. Концентрация дрожжей 20 г/л. В процессе сбраживания выдерживали температуру 30^oС, pН 4,2 и постоянное аэрирование 10 мин каждый час, длительность сбраживания составляла 36 ч.

Результаты сбраживания сахаров приведены в табл. 2.

Пример 3. Сбраживанию подвергали гидролизат, полученный в примере 1. Сбраживание проводили смесью дрожжевых культур: Sacharomyces uvarum раса Ф-С-2 и Candida sehata раса ВКПМ у-1632 в соотношении 1:1 при концентрации дрожжей 20 г/л. Условия сбраживания аналогично примерам 1 и 2.

Результаты испытаний приведены в табл. 2.

Как видно из приведенных примеров, гидролизат пивной дробины содержит более 80% пентозных сахаров, в том числе 57% ксилозы, что дает полное основание отнести его к гемицеллюлозным гидролизатам.

В результате конверсии гемицеллюлоз в этанол по предлагаемому способу эффективность процесса составила в среднем 40,5%, что на 26% выше, чем в прототипе.

В случае использования Sacharamyces uvarum количество утилизированной ксилозы было таким же, как в прототипе, в случае использования Candida sechata или смеси этих культур - ниже, чем в прототипе, но общая эффективность превращения сахаров в спирт на 30-50% выше, чем в прототипе, что и доказывает большую эффективность конверсии гемицеллюлоз в этанол.

Предлагаемый способ использования углеводов пивной дробины на спирт не требует дополнительного введения биологически активных веществ и питательных солей и осуществляется при более низкой концентрации дрожжей, чем в прототипе.

Таблица 1

Концентрация сахаров в гидролизате, %	Прототип	Изобретение
		Пример 1	Пример 2
Ксилоза	1,86	1,86	1,84
Арабиноза	0,18	0,95	1
Рамноза	0,05	0,02	0,01
Манноза	0,6	отсутствует
Глюкоза	0,83	0,08	0,06
Галактоза	0,13	0,34	0,32
Итого сахаров	3,63	3,25	3,33

Таблица 2

Сусло	Прототип	Пример 1	Пример 2	Пример 3
Культура дрожжей	У-1532	Ф-С-2	У-1632	Смесь дрожжевых культур
Концентрация сахаров в бражке, %
Ксилоза	0,9	0,89	1,01	1,31
Арабиноза	0,18	0,51	0,56	0,76
Рамноза	0,05	0,06	0,01	0,01
Манноза	следы	отсутствует	отсутствует	отсутствует
Глюкоза	следы	0,03	0,04	отсутствует
Галактоза	0,06	отсутствует	отсутствует	отсутствует
ИТОГО	1,19	1,49	1,62	2,08
Степень утилизации сахаров в % от исходных	67,4	54,2	49,8	36
Степень утилизации ксилозы в % от исходной	51,6	52,2	45,1	29,6
Выход этанола от сбраживаемых сахаров, %	32	41,7	32,5	47,2

http://www.findpatent.ru/patent/210/2109058.html
© FindPatent.ru - патентный поиск, 2012-2016

Для дрожжегенерирования при непрерывном сбраживании осахаренных заторов, не­зависимо от метода брожения (циклический или непрерывно-поточный), нужны две емкости для подготовки дрожжевого сусла: дрожжезаторный чан (дрожжанка) 15 и возбраживатель 16 (рис - 15). Дрожжезаторный чан (дрожжанка) приблизительно в 3 раза меньше возбраживателя (по объему), а возбраживатель в 3 раза меньше головного бродильного резервуара.

 

 

 

 

 

 

 

Первоначальная разводка дрожжей производится в дрожжезаторном чане, а в дальнейшем он может быть исключен из схемы воспроизводства дрожжей (вариант А) или использован наряду с возбраживателем (вариант Б).

Вариант А. Производят отъем бродящего затора при кон­центрации сухих веществ 8—10° Б из первого резервуара батареи и перекачивают его в предварительно промытый и пропаренный возбраживатель 16 (см. схему). Отъем подкисляют (при пере­мешивании) серной кислотой до 0,7—0,9°Д, расхолаживают до 21—23° и выдерживают 6—8 часов. После этого отъем на­правляют в первый бродильный чан, а освободившийся воз­браживатель промывают, пропаривают и, по мере надобно­сти, вновь наполняют отъемом бражки.

Вариант Б.Отъем бродящего затора при концентрации сухих веществ 8—10°Б производится так же, как и по вариан­ту «А» из первого бродильного чана, но не в возбраживатель, а в дрожжезаторный чан 15 (см. схему). Здесь бродящий за­тор подкисляется серной кислотой до 0,8° и выбраживает приблизительно в течение 5 часов до 5,5°Б, после чего дрож­жи в дрожжезаторном чане подвергаются чистке путем вто­ричного подкисления дрожжевого затора серной кислотой до 1,8—2,0°. При такой кислотности маточный дрожжевой затор выдерживается 2 часа, затем спускается в возбражи­ватель 16, куда одновременно подается осахаренное сусло (прошедшее теплообменник) при температуре 21—23° в ко­личестве, необходимом для заполнения возбраживателя. Мас­са в возбраживателе перемешивается с помощью пропел­лерной мешалки и подкисляется серной кислотой до 0,8°, после чего дображивает 10—12 часов. При видимом отброде 5—6°Б дрожжевой затор из возбраживателя спускается в первый резервуар бродильной батареи, вследствие чего кис­лотность бражки в первом резервуаре в начале цикла всег­да будет выше, чем в последующих.

Мичуринский опытный спиртовой завод, сбраживая сладкое сусло по непрерывно-поточному методу, ведет дрожжи по варианту «Б». Несмотря на выдержку дрожжевой матки при концентрации серной кислоты 1,8—2,0° в течение 2 ча­сов, в дрожжевом заторе все же сохраняются постоянные микроорганизмы.

В первых двух резервуарах батареи желательно создать максимальное численное превосходство дрожжевых клеток над посторонними микроорганизмами. В 1 мл бродящей массы количество дрожжевых клеток составляет в батарее Ми­чуринского спиртзавода: в резервуаре № 1 = 100 млн., в ре­зервуаре № 2 = 100 млн., в резервуарах № 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 = 130 млн.

Чтобы сусло начало быстро бродить, его следует сбраживать дрожжами, хорошо размешанными и аэрированными. Каждая дрожжевая клетка при брожении действует самостоятельно, поэтому если дрожжи плохо размешаны, то комки дрожжей оседают на дно и тем самым много дрожжевых клеток исключается из брожения. Дрожжи размешиваются и при этом аэрируются в аппаратах для предварительного брожения. Дрожжи нуждаются в кислороде только в начале брожения, а именно для размножения и роста, а собственно само брожение протекает уже без кислорода. Только в особых случаях, когда для сбраживания была использована небольшая доза дрожжей сусло перемешивают воздухом (аэрируют) в головном бродильном чане еще раз через 12 часов. Чаще всего для аэрирования используют сжатый воздух, очищенный от масел на фильтрах воздушной станции и прошедший через ватный фильтр, находящийся непосредственно в бродильном отделении. После основательного аэрирования вспененное сусло с дрожжами из аппарата предварительного сбраживания выжимают отфильтрованным воздухом в головной бродильный чан.

 

Биокатализатор для получения этанола из пентоз

В качестве таких биокатализаторов применяют природные штаммы мицелиальных грибов родов Rhizopus Aspergillus, Fuzarium и Mucor, способные сбраживать различные сахара, в том числе и пентозы, в этанол [Olsson L., Hahn-Hägerdal В. (1996) Fermentation of lignoellulosic hydrolysates for ethanol production. // Enzyme Microb. Technol., V.18, p.312-331]. Биокатализаторы, представляющие собой развитый метаболически активный мицелий гриба, получают культивированием спор в богатых питательных средах в аэробных условиях с последующим их применением для получения этанола из пентоз в анаэробных условиях. В качестве источника сбраживаемых сахаров могут быть использованы как растворы индивидуальных пентоз, так и среды, содержащие пентозы в составе сложных смесей сахаров, в частности химические и ферментативные гидролизаты целлюлозосодержащего сырья [Millati R., Edebo L., Taherzadeh M.J. (2005) Performance of Rhizopus, Rhizomucor, and Mucor in ethanol production from glucose, xylose, and wood hydrolyzates. // Enz. Microb. Technol., V.36, p.294-300].

Эффективность биокатализаторов, предназначенных для конверсии пентоз в этанол, удобно сравнивать по следующим показателям:

- длительность процесса конверсии (ч);

- выход этанола в расчете на исходный субстрат (%);

- продуктивность процесса или скорость конверсии (сбраживания), определяемая как концентрация целевого продукта - этанола, отнесенная к длительности процесса конверсии (г/л/ч).

Известен биокатализатор для получения этанола из пентоз, представляющий собой мицелий гриба Aspergillus terreus [Pushalkar S., Rao K.K. (1998) Short communication: Ethanol fermentation by a cellulolytic fungus Aspergillus terreus. II World J. Microbiol. Biotechn., V.14, p.289-291]. Для получения биокатализатора 108 спор/мл вносят в питательную среду, содержащую 1% глюкозы и набор солей, необходимых для роста клеток, затем проводят культивирование клеток в аэробных условиях при 28°С при постоянном перемешивании в течение 24 ч. Полученный биокатализатор в анаэробных условиях обеспечивает выход этанола из ксилозы 5,6% за 144 ч, а из арабинозы - 8% за 120 ч. Продуктивность процесса конверсии (скорость сбраживания) составляет соответственно 0,02 и 0,03 г/л/ч. Основным недостатком этого биокатализатора является крайне низкая продуктивность процесса, которую он обеспечивает.

Известен биокатализатор на основе клеток мицелиального гриба Mucor indicus для получения этанола из пентоз, присутствующих в среде в качестве единственного источника сбраживаемых сахаров, или входящих в состав смесей сахаров в кислотных гидролизатах древесины [Sues A., Millati R., Edebo L., Taherzadeh M.J. (2005) Ethanol production from hexoses, pentoses, and dilute-acid hydrolyzate by Mucor indicus.11 FEMS Yeast Research, V.5, p.669-676]. Для получения биокатализатора 1 мл суспензии спор с концентрацией (5-6)×106 спор/мл вносят в 150 мл питательной среды, содержащей 33 г/л глюкозы и необходимый набор солей и органических компонентов. Проводят культивирование клеток до формирования метаболически активного мицелия при 30°С в аэробных условиях при постоянном перемешивании в течение 24 ч. При конверсии индивидульных пентоз выход этанола составляет: из ксилозы 18% за 88 ч, из арабинозы 15% за 93 ч, что соответствует скорости сбраживания - 0,068 или 0,053 г/л/ч соответственно. Выход этанола при конверсии ксилозы, присутствующей в составе кислотных гидролизатов отходов переработки древесины хвойных пород, составляет 13,3%, а скорость сбраживания 0,025 г/л/ч. К недостаткам биокатализатора следует отнести невысокую скорость сбраживания пентоз и относительно невысокие выходы целевого продукта.

Применение аналогичного катализатора, полученного в условиях повышенной температуры (37°С) при контроле рН среды (5,0±0,7), позволяет повысить выход целевого продукта до 22% от внесенного субстрата, а скорость сбраживания до 0,11 г/л/ч. [Millati R., Edebo L., Taherzadeh M.J. (2005) Performance of Rhizopus, Rhizomucor, and Mucor in ethanol production from glucose, xylose, and wood hydrolyzates.// Enz. Microb. TechnoL, V. 36, p.294-300]. Однако использование повышенных температур и необходимость контроля рН технологически и экономически усложняет процесс. Повышение температуры способствует снижению продуктивности биокатализатора под действием накапливающегося этанола.

Известны биокатализаторы, представляющие собой клетки мицелиальных грибов Rhizopus javanicus или Rhizopus oryzae, предназначенные для получения этанола из ксилозы [Skory C.D., Freer S.N., Bothast R.J. (1997) Screening for ethanol-producing filamentous fungi. // Biotechn. Lett., V.19, p.203-206]. Для получения биокатализатора 108 споры вносят в 20 мл питательной среды, содержащей 0,3% дрожжевого экстракта, 0,5% пептона, 0,3% солодового экстракта и 50 г/л ксилозы. Проводят культивирование клеток до формирования метаболически активного мицелия в аэробных условиях при постоянном перемешивании в течение 24 ч. Выход этанола составляет 23,4% (Rhizopus javanicus) и 21,6% (Rhizopus oryzae) от внесенного субстрата, а скорость сбраживания соответственно - 0,16 или 0,15 г/л/ч.

Общим недостатком всех описанных биокатализаторов является то, что все они рассчитаны на однократное применение. Невозможность повторного использования связана с быстрым ухудшением первоначальных характеристик биокатализатора под воздействием накапливающегося в среде этанола и вследствие снижения рН среды за счет растворения выделяющегося в процессе брожения СО2 и накопления побочных продуктов, в частности уксусной кислоты и других органических кислот. Невозможность повторного использования биокатализатора создает проблему постоянного наращивания свежей биомассы и утилизации отработанных клеток и делает процесс экономически неэффективным.

Улучшить характеристики биокатализатора и повысить его привлекательность для использования в промышленных процессах позволяет его получение в иммобилизованном виде.